Teknik Aseptik

Dalam melakukan analisis mikrobiologi diperlukan teknik aseptik secara terus menerus yang bertujuan untuk meminimalkan kontaminasi area kerja, alat dan bahan yang akan digunakan.

Untuk menjamin keberhasilan suatu pekerjaan di laboratorium mikrobiologi, teknik aseptik harus diaplikasikan dengan tepat agar tidak terjadi kontaminasi. Sebelum dan sesudah melakukan analisis mikrobiologi area kerja harus disanitasi menggunakan alkohol 70%, analis harus menggunakan Alat Pelindung Diri (APD) lengkap, alat dan bahan harus terus dipertahankan dalam kondisi steril, sebelum dan setelah membuka alat gelas harus dilewatkan ke sumber api.

Pembuatan Media Padat dan Media Cair

Media biakan pada dasarnya digunakan untuk menumbuhkan, mengisolasi, menguji sifat-sifat fisiologi, hingga sebagai bahan dalam menghitung jumlah mikroorganisme.

Media biakan adalah suatu substrat yang diperlukan untuk menumbuh dan mengembangbiakan mikroorganisme. Syarat media biakan: mengandung semua nutrisi yang dibutuhkan dan mudah dicerna mikroorganisme, mempunyai pH, tekanan osmotik, dan tegangan permukaan yang sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme serta steril. Untuk menghasilkan media biakan yang dapat menjadi tempat mikroorganisme tumbuh optimal, maka peserta didik dituntut untuk memahami tata cara pembuatan media yang baik serta mengetahui syarat-syarat yang dibutuhkan media agar dapat berfungsi secara baik. Media biakan yang dibuat harus disterilkan dengan menggunakan sterilisator autoklaf selama 15 menit pada suhu 121℃ dan tekanan 15 psi/1 atm.

Uji Kinerja Media Padat dan Cair

Media biakan yang sudah dibuat harus dipastikan mutu/kualitasnya dengan cara dilakukan kontrol mutu media.

Kontrol negatif dilakukan untuk mengetahui kesterilan media yang akan digunakan dan mengetahui kinerja dari autoklaf, ditandai dengan setelah inkubasi media biakan tidak ditumbuhi bakteri. Kontrol positif dilakukan untuk mengetahui kemampuan media biakan dalam menumbuhkan suatu mikroorganisme, ditandai dengan setelah inkubasi media biakan ditumbuhi bakteri. Kontrol negatif dan kontrol positif media biakan dilakukan secara aseptik kemudian diinkubasi dengan menggunakan inkubator pada suhu dan waktu yang sesuai.

Uji Swab Area Kerja

Uji swab merupakan analisis yang dilakukan untuk memeriksa kondisi mikroorganisme yang terdapat di lingkungan dan area kerja. Area kerja di laboratorium mikrobiologi harus dipastikan bebas dari kontaminan.

Uji swab area kerja dilakukan dengan cara mencuplik sampel di area kerja dengan luasan area 5x5 cm, kemudian ditumbuhkan pada media padat dan diinkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai.

Isolasi Bakteri

Isolasi bakteri adalah memisahkan satu mikroba dari lingkungan yang memiliki banyak jenis mikroba (mixed culture) menjadi hanya satu jenis mikroba (pure culture).

Teknik isolasi bakteri yang paling umum dilakukan adalah teknik goresan kuadran secara aseptik dengan sumber yang berasal dari suspensi bakteri campuran pada media biakan padat (plate) kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam agar diperoleh kultur murni dalam bentuk koloni yang terpisah. Koloni bakteri terpisah memiliki ciri: terpisah, bentuknya bulat, tepian koloninya reguler dan berbentuk seperti pasta/krim.

Inokulasi Bakteri

Inokulasi bakteri adalah proses menanam bakteri dengan teknik goresan secara aseptik pada media biakan padat kemudian diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu.

Inokulasi juga memiliki tujuan untuk memindahkan bakteri dari medium lama ke medium baru dengan ketelitian yang sangat tinggi (teknik aseptik). Inokulasi menggunakan sumber berupa koloni bakteri terpisah yang ada pada isolat, kemudian digoreskan pada agar miring (slant) dengan bentuk goresan zig-zag secara aseptik agar diperoleh koloni bakteri tanpa terkontaminasi.

Motilitas/Pergerakan Mikroorganisme

Motilitas atau pergerakan mikroorganisme dapat diamati dengan cara tetes gantung di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x

Motilitas/pergerakan mikroorganisme adalah suatu kemampuan mikroorganisme untuk bergerak secara mandiri dari satu tempat ke tempat lain, biasanya untuk mencari nutrisi, menghindari kondisi yang merugikan, serta adaptasi pada rangsangan/kondisi tertentu. Gerakan ini dapat dibedakan menjadi gerakan aktif dan pasif. Gerak aktif terjadi karena mikroorganisme memiliki alat gerak, seperti: flagela, silia atau struktur kontraktil lainnya. Gerak pasif disebabkan oleh pengaruh luar (gerak Brown).

Pewarnaan Positif Sederhana

Pewarnaan merupakan suatu teknik untuk mempelajari morfologi bakteri dengan cara pemberian zat warna pada sel bakteri. Melalui pewarnaan juga dapat mengetahui bentuk, ukuran, struktur luar, dan struktur dalam bakteri dengan menggunakan zat warna tertentu.

Pewarnaan ini menggunakan satu zat warna di mana molekul-molekul zat warna yang digunakan lebih kecil dari pori-pori sel bakteri sehingga sel-sel bakteri dan bagian-bagiannya akan terwarnai dan lapang pandang akan berwarna transparan. Preparat pewarnaan positif diamati menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000x dengan bantuan minyak imersi.

Pewarnaan Negatif

Pewarnaan ini menggunakan satu zat warna di mana molekul-molekul zat warna yang digunakan lebih besar dari pori-pori sel bakteri sehingga sel-sel bakteri dan bagian-bagiannya tidak akan terwarnai dan lapang pandang akan terwarnai. Preparat pewarnaan negatif diamati menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000x dengan bantuan minyak imersi.

Pembuatan Yogurt

Yogurt adalah produk olahan yang terbuat dari bahan susu yang difermentasikan menggunakan bakteri Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus.

Diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Hasil fermentasi berupa asam laktat dan asam piruvat. Yogurt memiliki manfaat untuk memperlancar sistem pencernaan, menurunkan kadar kolesterol, dan meningkatkan imun tubuh.

Pewarnaan Bakteri Berspora Metode Schaeffer-Fulton

Pewarnaan spora merupakan suatu teknik untuk mengidentifikasi bentuk, ukuran, struktur luar, serta struktur dalam bakteri dengan cara memberikan zat warna pada spora.

Spora dilapisi oleh lapisan korteks yang tebal, sehingga ketika dipanaskan lapisan korteks akan terbuka dan zat warna akan masuk, tetapi ketika didinginkan lapisan korteks kembali menutup dan mengeras, zat warna akan terperangkap dalam spora sedangkan sel vegetatif diwarnai oleh zat warna kedua. Preparat pewarnaan bakteri berspora diamati menggunakan mikroskop binokuler dengan perbesaran 1.000x akan diperoleh warna dari lapang pandang transparan, warna spora hijau dan warna sel vegetatif merah, dengan berbagai macam letak spora, yaitu: sentral (spora berada di tengah sel), sub-terminal (spora berada hampir di ujung sel) dan terminal (spora berada di ujung sel).

Pewarnaan Gram metode Preston-Morrel

Pewarnaan Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri yang terwarnai terbagi menjadi dua kelompok yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel. Bakteri Gram positif dapat menahan persenyawaan iodin kompleks karena memiliki lapisan peptidoglikan tebal sehingga bakteri akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan berwarna ungu sementara bakteri Gram negatif dapat melepaskan persenyawaan iodine kompleks karena memiliki peptidoglikan tipis dan memiliki lapisan lemak (lipid), sehingga hanya mengikat zat warna kedua dan berwarna merah. Iodine kompleks terbentuk dari KI dan I2 dengan warna kristal violet sewaktu dicuci dengan decolorizer. Preparat pewarnaan Gram diamati menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000x dengan bantuan minyak imersi, Gram positif berwarna ungu dan Gram negatif berwarna merah dengan lapang pandang transparan.

Pewarnaan BTA dan BTTA Metode Ziehl-Neelsen

Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki dinding sel tebal yang terdiri dari lapisan lilin berupa asam lemak mikolat yang tinggi pada dinding selnya. Salah satu contoh bakteri tahan asam adalah Mycobacterium tuberculosis yang menjadi penyebab penyakit tuberkulosis.

Tetapi apabila diwarnai dengan larutan fuchsin pekat yang mengandung fenol sambil dipanaskan, lapisan lilin pada BTA akan pecah dan zat warna akan masuk ke dalam sel bakteri. Lapisan luar dari bakteri juga dapat menahan penembusan bahan penghilang warna (pencuci) sehingga sekalipun bakteri itu dicuci dalam asam kuat, tetap akan mempertahankan zat warna yang telah diberikan. Bakteri tidak tahan asam setelah proses dekolorisasi akan melepaskan zat warna pertama dan akan mengikat zat warna kedua. Preparat pewarnaan BTA-BTTA diamati menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000x dengan bantuan minyak imersi, BTA berwarna merah dan BTTA berwarna biru dengan lapang pandang transparan.

Perhitungan Jumlah Bakteri Cara Angka Paling Mungkin

Metode APM Suatu metode statistik berbasis teori probabilitas/kemungkinan. Teknik memperkirakan jumlah mikroorganisme viabel dalam suatu sampel/contoh.

Metode APM menggunakan tabung durham yang dimasukkan secara terbalik ke dalam tabung ulir yang berisi media cair. Perhitungan jumlah bakteri dengan cara APM tidak dihitung satu-satu berdasarkan jumlah koloninya tetapi diamati reaksi atau perubahan yang terjadi pada tabung tersebut setelah diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Indikator adanya aktivitas bakteri ditandai dengan terbentuknya gelembung gas pada tabung durham dan/atau perubahan warna pada media yang menjadi lebih keruh. Nilai APM suatu sampel dapat diketahui dengan cara menghitung tabung positif pada masing-masing kelompok pengenceran kemudian hitung jumlah bakteri dengan bantuan tabel indeks APM yang sesuai.

Perhitungan Jumlah Kapang-Khamir Cara Tuang

Perhitungan jumlah kapang-khamir cara tuang perlu dilakukan untuk mengetahui tingkat pencemaran suatu sampel akibat pertumbuhan kapang-khamir.

Perhitungan jumlah kapang khamir cara tuang dilakukan dengan pengenceran contoh 10-1 s.d. 10-3 dan blanko kemudian dari masing-masing pengenceran dipipet sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri dan dituang media padat untuk pertumbuhan kapang khamir sebanyak 15-20 ml lalu diinkubasi pada suhu 25-28°C selama 3-5 hari. Hitung jumlah koloni kapang dan khamir pada setiap cawan petri dengan alat instrumen colony counter yang dilengkapi dengan kaca pembesar kemudian dihitung menggunakan kaidah Bacteriological Analytical Manual (BAM).

Total Coliform Cara Angka Paling Mungkin

Keberadaan total bakteri coliform dalam sampel air dapat diketahui melalui metode angka paling mungkin (APM).

Bakteri coliform termasuk bakteri Gram negatif, berbentuk basil, tidak berspora, dapat memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas ketika diinkubasi pada suhu 37ºC. Salah satu contoh bakteri coliform adalah Escherichia coli.

Identifikasi Bakteri Patogen

Pemeriksaan bakteri patogen dilakukan setelah proses pengerjaan perhitungan jumlah bakteri cara APM dan perhitungan jumlah coliform cara APM.

Hasil pengujian yang positif (keruh dan bergas) dari pengerjaan sebelumnya digoreskan pada media selektif steril (plate) lalu diinkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai. Bakteri patogen yang ditanam pada media akan tumbuh dan membentuk koloni dengan karakteristik tertentu berdasarkan bentuk, pinggir, elevasi, ukuran, warna, dan tekstur koloninya. Salah satu faktor yang memengaruhi pertumbuhan bakteri patogen adalah jenis media selektif yang digunakan. Contoh media selektif seperti media Brilliant Green Agar (BGA) dapat digunakan khusus untuk pertumbuhan bakteri Salmonella dan Shigella atau media MacConkey Agar (MCA) yang digunakan untuk seleksi Gram negatif seperti Escherichia coli. Jika diperoleh hasil yang positif maka akan dilanjutkan dengan pengujian biokimia.

Uji Daya Hambat

Uji daya hambat adalah metode untuk mengukur kemampuan suatu zat antimikroba dalam menghambat pertumbuhan mikroorganisme yang ditandai dengan terbentuknya zona bening atau zona hambat.

Hasil pengujian daya hambat suatu antibiotik berbeda-beda tergantung dari konsentrasi zat, luasan area sumur, waktu difusi sampel, dan kepekatan suspensi bakteri yang digunakan.

Koefisien Fenol Suatu Desinfektan

Keefektifan suatu desinfektan didasarkan pada konsentrasi dan waktu kontak antara desinfektan tersebut dengan bakteri.

Desinfektan dinyatakan efektif bila dapat membunuh mikroorganisme. Keefektifan suatu desinfektan diukur dalam angka/koefisien fenol. Keefektifan suatu desinfektan diukur dalam angka/koefisien fenol. Dilakukan pengenceran pada desinfektan dan fenol, lalu ditambahkan media biakan umum pada menit ke-5, 10 dan 15 kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.

Angka Lempeng Total / Total Plate Count

Pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil dalam suatu produk dengan cara dilakukan pengenceran kemudian diinokulasikan pada media lempeng Agar (plate) dengan cara tuang lalu diinkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai.

Angka lempeng total dilakukan pengenceran contoh 10-1 s.d. 10-3 dan blanko kemudian dari masing-masing pengenceran dipipet sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri dan dituang media padat untuk pertumbuhan bakteri sebanyak 15-20 ml lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Hitung jumlah koloni pada setiap cawan petri dengan alat instrumen colony counter yang dilengkapi dengan kaca pembesar kemudian dihitung menggunakan kaidah Bacteriological Analytical Manual (BAM).