Teknik aseptik

Dalam melakukan analisis mikrobiologi diperlukan teknik aseptik secara terus menerus yang bertujuan untuk meminimalkan kontaminasi area kerja, alat dan bahan yang akan digunakan.

Untuk menjamin keberhasilan suatu pekerjaan di laboratorium mikrobiologi, teknik aseptik harus diaplikasikan dengan tepat agar tidak terjadi kontaminasi. Sebelum dan sesudah melakukan analisis mikrobiologi area kerja harus disanitasi menggunakan alkohol 70%, analis harus menggunakan Alat Pelindung Diri (APD) lengkap, alat dan bahan harus steril, sebelum dan setelah membuka alat gelas harus dilewatkan ke sumber api.

Pembuatan media padat dan media cair

Media mikroorganisme pada dasarnya digunakan untuk menumbuhkan, mengisolasi, menguji sifat-sifat fisiologi, hingga sebagai bahan dalam menghitung jumlah mikroorganisme.

Untuk menghasilkan media yang dapat menjadi tempat mikroorganisme tumbuh dengan baik, maka peserta didik dituntut untuk memahami tata cara pembuatan media yang baik serta mengetahui syarat-syarat yang dibutuhkan media agar dapat berfungsi secara baik. Media biakan yang dibuat harus disterilkan dengan menggunakan sterilisator autoklaf selama 15 menit pada suhu 121℃ dan tekanan 15 Psi/1 ATM.

Uji sterilitas dan uji efektivitas media padat dan media cair

Media biakan yang sudah dibuat harus dipastikan mutu/kualitas nya dengan cara dilakukan uji sterilitas dan uji efektivitas.

Uji sterilitas dilakukan untuk mengetahui kesterilan media yang akan digunakan dan mengetahui kinerja dari autoklaf. Uji efektivitas dilakukan untuk mengetahui kemampuan media biakan dalam menumbuhkan suatu mikroorganisme. Uji sterilitas dan uji efektivitas dilakukan secara aseptik kemudian diinkubasi dengan menggunakan inkubator pada suhu dan waktu yang sesuai.

Uji swab area kerja

Area kerja di laboratorium mikrobiologi harus dipastikan bebas dari kontaminan.

Uji swab area kerja dilakukan dengan cara mencuplik sampel di area kerja dengan luasan area 5x5 cm, kemudian ditumbuhkan pada media padat dan diinkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai.

Isolasi

Isolasi bakteri adalah proses menanam bakteri dengan teknik goresan secara aseptik pada media biakan padat kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam agar diperoleh kultur murni dalam bentuk koloni yang terpisah.

Inokulasi

Inokulasi adalah proses pemisahan koloni dari biakan campuran secara aseptik hingga diperoleh biakan murni pada media biakan kemudian diinkubasi dengan suhu 37°C selama 24 jam.

Motilitas mikroorganisme

Motilitas atau pergerakan mikroorganisme dapat diamati dengan cara tetes gantung dibawah mikroskop dengan perbesaran 100x.

Pewarnaan positif sederhana

Pewarnaan bakteri adalah suatu teknik untuk mengetahui bentuk, ukuran, struktur luar, dan struktur dalam bakteri dengan menggunakan zat warna tertentu.

Pewarnaan ini menggunakan satu zat warna dimana molekul-molekul zat warna yang digunakan lebih kecil dari pori-pori sel bakteri sehingga sel-sel bakteri dan bagian-bagiannya akan terwarnai dan lapang pandang akan berwarna transparan.

Pewarnaan negatif

Pewarnaan ini menggunakan satu zat warna dimana molekul-molekul zat warna yang digunakan lebih besar dari pori-pori sel bakteri sehingga sel-sel bakteri dan bagian-bagiannya tidak akan terwarnai dan lapang pandang akan terwarnai.

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel.

Bakteri Gram positif adalah segolongan bakteri yang dapat menahan persenyawaan iodine kompleks. Iodine kompleks terbentuk dari KI dan I2 dengan warna kristal violet amonium oksalat sewaktu cuci.

Bakteri Gram negatif adalah segolongan bakteri yang melepaskan persenyawaan dan zat warna tadi tetapi mengikat zat warna berikutnya yaitu karbol fuchsin encer/safranin.

Pewarnaan bakteri berspora

Pewarnaan spora merupakan suatu teknik untuk mengidentifikasi bentuk, ukuran, struktur luar, serta struktur dalam bakteri dengan cara memberikan zat warna pada spora.

Spora dilapisi oleh lapisan korteks yang tebal, sehingga ketika dipanaskan lapisan korteks akan membuka dan zat warna akan masuk, tetapi ketika didinginkan lapisan korteks kembali menutup dan mengeras, zat warna akan terperangkap dalam spora sedangkan sel vegetatif diwarnai oleh zat warna kedua.

Pewarnaan BTA-BTTA

Beberapa bakteri seperti Mycobacterium tuberculosis tidak dapat terwarnai dengan cara sederhana, sehingga perlu diamati dengan metode pewarnaan khusus. Mycobacterium memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat.

Tetapi apabila diwarnai dengan larutan fuchsin pekat yang mengandung fenol sambil dipanaskan, lapisan lilin tadi akan pecah dan zat warna akan masuk ke dalam sel bakteri. Lapisan luar dari bakteri juga dapat menahan penembusan bahan penghilang warna (pencuci) sehingga sekalipun bakteri itu dicuci dalam asam kuat, tetap akan mempertahankan zat warna yang telah diberikan tadi. Bakteri semacam ini disebut bakteri tahan asam (BTA) sedangkan bakteri tidak tahan asam.

Pembuatan yogurt

Yogurt adalah produk olahan yang terbuat dari bahan susu yang difermentasikan menggunakan bakteri Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus.

Diinkubasi pada suhu 40°C, selama 24 jam. Hasil fermentasi berupa asam laktat dan asam piruvat.

Perhitungan jumlah bakteri cara tuang

Perhitungan jumlah bakteri cara tuang ini dilakukan dengan pengenceran contoh 10^-1 s/d 10^-3 dan blanko kemudian dari masing-masing pengenceran dipipet sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri dan dituang media padat untuk pertumbuhan bakteri sebanyak 15-20 ml lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.

Hitung jumlah koloni pada setiap cawan petri dengan alat instrumen colony counter yang dilengkapi dengan kaca pembesar kemudian dihitung rata-rata dari 2 cawan dengan pengenceran yang setingkat sesuai dengan kaidah yang berlaku.

Perhitungan jumlah kapang khamir cara tuang

Perhitungan jumlah kapang khamir cara tuang ini dilakukan dengan pengenceran contoh 10^-1 s/d 10^-3 dan blanko kemudian dari masing-masing pengenceran dipipet sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri dan dituang media padat untuk pertumbuhan kapang khamir sebanyak 15-20 ml lalu diinkubasi pada suhu 25-28°C selama 2-5 hari.

Hitung jumlah koloni kapang dan khamir pada setiap cawan petri dengan alat instrumen colony counter yang dilengkapi dengan kaca pembesar kemudian dihitung rata-rata dari 2 cawan dengan pengenceran yang setingkat sesuai dengan kaidah yang berlaku.

Perhitungan jumlah bakteri cara angka paling mungkin

Metode APM Suatu metode statistik berbasis teori probabilitas/kemungkinan. Teknik memperkirakan jumlah mikroorganisme viabel dalam suatu sampel/contoh.

Perhitungan total Coliform cara angka paling mungkin

Analisis kuantitatif mikrobiologi menghitung jumlah jasad renik dalam suatu suspensi, salah satunya adanya bakteri Coliform pada makanan dan minuman dengan metode APM (Angka Paling Mungkin)/ Most Probable Number (MPN).

Bakteri Coliform kelompok bakteri berbentuk batang, Gram-negatif, aerob sampai anaerob fakultatif, tidak membentuk spora, mampu tumbuh secara aerobik pada media agar yang mengandung garam empedu, dan mampu memfermentasikan laktosa dengan membentuk gas dan asam dalam waktu 48 jam pada suhu 37°C.

Identifikasi bakteri patogen

Pemeriksaan bakteri patogen ini dilakukan setelah proses pengerjaan perhitungan jumlah bakteri cara APM dan perhitungan jumlah coliform cara APM.

Hasil pengujian yang positif (keruh dan bergas) dari pengerjaan sebelumnya digoreskan di media selektif steril (plate) lalu diinkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai.

Uji Daya Hambat

Uji daya Hambat dilakukan untuk mengukur kemampuan suatu zat dalam menghambat pertumbuhan bakteri.

Koefisien Fenol

Keefektifan suatu desinfektan didasarkan pada konsentrasi dan waktu kontak antara desinfektan tersebut dengan bakteri.

Desinfektan dinyatakan efektif bila dapat membunuh mikroba (bakteri). Keefektifan suatu desinfektan diukur dalam angka/koefisien fenol.